كاربرد راديوايزوتوپ‌ها در بيولوژي (زيست‌شناسي)قسمت-۳

 تجزيه به روش فعال‌سازي

عناصر متعددي در سيستم‌هاي بيولوژيكي در مقادير كم مقدار يا فوق كم مقدار وجود دارند. بعضي از آنها داراي نقش فيريولوژيكي مهم بوده و اساسي هستند. مثلاً، كبالت، مس، يد، آهن، منگنز، سلنيم و غيره. اين عناصر داراي بازه متغيري از فعاليت‌هاي بيوشيميايي در بدن بوده و  نقش اصولاً حياتي در سيستم‌هاي آنزيمي دارند.

در دسترس بودن نوترون‌هاي با شار بالا در رآكتورها امكان اندازه‌گيري غلظت‌هاي بسيار پايين خيلي از عناصر در مواد بيولوژيكي را به وجود آورده است. اين كار با استفاده از تجزيه به روش فعال‌سازي با نوترون (NAA) كه داراي حساسيت بسيار بالايي است امكان‌پذير شده است. (فصل 14 را براي توضيح بيشتر ملاحظه كنيد). در مقادير فوق كم (kg/mg 10)، نمونه‌هاي شاهد و ماتريس وابسته نيز نقش مهمي در تعيين حساسيت بازي مي‌كنند. يگانه مزيتي كه تجزيه به روش فعال‌سازي نوتروني دارد اين است كه ناخالصي‌هاي شيميايي ماده ردياب در معرف كه در جداسازي راديوشيميايي به كار مي‌رود همانند ساير آلودگي‌هاي شيميايي نمونه، پس از فعال‌سازي نتيجه اندازه‌گيري ايزوتوپ متناظر را متأثر نمي‌سازد. متدولوژي تجزيه به روش فعال‌سازي در فصل 14 آمده است.

 

كاربردها در بيولوژي مولكولي

تكنيك‌ها در بيولوژيكي مولكولي انقلابي را در تفكر انسان ايجاد نموده‌اند به طريقي كه وي را قادر به جابه‌جايي سيستم‌هاي ژنتيك جهت آفرينش ارگانيزم‌هاي جديد نموده است. انجام حساس توليد مثل غير لقاحي (تكثيرسلول‌ها) گوسفند، دالي (Dolly)، اوج اين فعاليت‌ها در قرن حاضر است. كاربردهاي اين روش‌ها در زمينه‌هاي گوناگون همچون تشخيص سريع قبل و بعد از تولد نقص‌هاي ژنتيكي، فهم و بهبودي سرطان و چندين بيماري ژنتيكي، توليد واكسن‌هاي مؤثر و با هزينه پايين در مقابل باكتري، بيماري ويروسي و تك ياخته‌‌اي، توليد گياهان جديد كه ازت را مستقيماً از هوا مي‌گيرند در مقابل كودگران توليد گياهان گوناگون با بهره بالا، اصلاح حيوانات براي ميزان گوشت و شير بيشتر و جابه‌جايي سلول‌هاي ميكروبي و هسته‌هاي ايوكاريتوتيك براي توليد محصولات مختلف صنعتي و دارويي مي‌باشد.

پيشرفت سريع و گسترش اين تكنولوژي در ابتدا بستگي به كاربرد ردياب‌هاي راديوايزوتوپي دارد كه براي آشكارسازي، تشخيص و تخمين شناسايي ژن‌ها و محصولات ژني دارد. امروزه، ردياب‌هاي ديگر همچون نشانگرهاي فلورسان و واكنش‌هاي كالريمتري
جايگزين – آنزيم شهرت بالاتري را به دست آورده و جايگزين به كارگيري راديوايزوتوپ‌ها در بسياري از روش‌ها شده‌اند. از آنجا كه اين فصل در ابتدا بحث كاربردهاي راديوايزوتوپ‌ها مطرح كرده، بعضي از تكنيك‌ها كه در آن‌ها اتم‌ها با مواد اوليه اسيدنوكلئيك براي توليد اسيد نوكلئيك نشان‌دار همراه است در ذيل توضيح داده مي‌شود.

 

توسعه اوليه

توسعه اوليه روشي است كه براي نشان‌دار نمودن يكنواخت DNA با نوكلئوتيدهاي نشان‌دار با P32 به كار رفته است. يك صفحه تك زنجيره زنجيره DNA به اوليگونوكلئوتيد اوليه به
آهستگي سرد (آنيل) مي‌گردد. پليمر DNA با الحاق اين ناحيه زنجيره‌اي دوگانه كوتاه كار مي‌كند. بدين ترتيب، اين روش نشان‌داركردن يكنواخت نياز به يك آغاز‌گر دارد كه با ترتيب رشته تطابق دارد. اليگونوكلئوتيدها درنقاط زيادي در امتداد طول خود به زنجيره‌هاي DNA به آهستگي سرد مي‌شوند، لذا، آغازگرهايي را تأمين مي‌كنند كه پليمر براي سنتز اوليه DNA نياز دارد. رشته پيوند نشده به وسيله شستشو حذف مي‌گردد. رشته نشان‌دار ايزوتوپي به هدف پيوند مي‌خورد كه سپس به وسيله اوتوراديوگرافي انتخاب مي‌شود. با به كار بردن چنين روش‌هايي، مقادير كم DNA در حدود يك پيكوگرم بر هر پيوند مي‌تواند آشكارسازي گردد.

 

كاربردها

·         آشكارسازي همولوژي ژنتيك بين گونه‌هاي متفاوت ارگانيزم‌ها.

·          تشخيص حضور بيماري‌هاي فاميلي بر مبناي ژنتيكي.

 

انتقال نيك (Nick)

انتقال نيك يكي از روش‌هاي متعددي است كه براي نشان‌دار نمودن يكنواخت DNA با P32 نوكلئوتيدهاي نشان‌دار به كار مي‌رود.

اين روش مستلزم حذف نوكلئوتيدهاي غيرنشان‌دار از زنجيره DNA با جايگزيني همزمان نوكلئوتيدهاي حذف شده به وسيله نوكلئوتيدهاي نشان‌دار P32 مي‌باشد. هر دو اين اكتيويته‌ها به وسيله آنزيم يكسان پليمرها از DNA اجراء مي‌شود.

 

كاربردها

·         هيبريديزاسيون براي آشكارسازي و شناسايي مولكول‌هاي گوناگون DNA .

·          ترتيب‌گذاري DNA وRNA .

·          نگاشت اسيدهاي نوكلئيك در ژن‌ها.

 

هيبريديزاسيون

هيبريديزاسيون براساس اين اصل است كه بخش كوتاهي از DNA نشان‌دار با P32 (سوند) مي‌تواند بخش DNA تكميلي در امتداد گسترده ژنومي DNA هر ارگانيزم باشد.

كاربردها

·         تشخيص بيماري‌هاي ويروسي

·          طب جنائي

·          تاريخچه مناقشات والديني

 

هيبريديزاسيون جنوبي (Southern Hybridisation)

با به كار بردن اين روش، اجزاء DNA به وسيله الكتروفوريز ژل آگاروز (agarose) جداسازي شده و زنجيره دوگانه DNA با كشت ژل در محيط بازي مجدداً خنثي مي‌شوند. پس از خنثي شدن در محيط بازي، ژل با يك مخزن حاوي محلول بافر نمك ارتباط پيدا كرده و با يك غشاء ميكروسلولي اندود مي‌گردد. بافر از مخزن و از ميان ژل جريان پيدا كرده آن را با اجزاء DNA حمل نموده و توليد پيوند در ژل مي‌نمايد. اين غشاء حمل كننده DNA با يك رشته نشان‌دار راديواكتيو هيبريد مي‌گردد. پيوندهاي هيبريداسيون به وسيله اوتوراديوگرافي آشكارسازي مي‌شوند.

 

كاربردها

·         تشخيص بيماري‌هاي ژنتيكي مثل سيستيك فيبروسيس.

·          تعيين توالي ژن‌ها در ارگانيزم‌هاي همگن.

هيبريديزاسيون شمالي مشابه فرآيند به كار رفته براي مولكول‌هاي  RNAمي‌باشد.

 

ترتيب‌گذاري اسيد نوكلئيك

توالي نوكلئوتيدها در قطعه‌اي از DNA مي‌تواند به وسيله روش‌هاي ترتيب‌گذاري  اسيدنوكلئيك تعيين گردد. دو روش اساسي به كار رفته عبارتند از :

1-     روش ماگزام(Maxam) و گيلبرت(Gilbert) با به كار بردن تخريب شيميايي 

2-     روش پايانه زنجيره ديدِكسي سنجر(Sanger).

 

روش ماگزام گيلبرت (روش فساد شيميايي)

يك پاره از DNA به طور ايزوتوپي با P32 در پايانه پنجم يا سوم خود هر كدام از دو طرف زنجيره جدا و منفك مي‌گردد. سپس DNA به صورت برخه‌اي با عوامل شيميايي براي محيط‌هاي بازي مختلف(A، T، C و G)(1) اصلاح شده و در نوكلئوتيدهاي اصلاح شده چسبيده مي‌شود. اين روش، توليد يك سري مولكول‌هاي متفاوت در طول ولي با پايانه نشان‌دار ايزوتوپي يكسان مي‌كند. اين پاره‌ها مربوط به خنثي نمودن الكتروفوريز ژل به موازات شكاف‌ها در يك ژل با قدرت بالاي تفكيك بوده و ترتيب DNA مي‌‌تواند از نتيجه اتوراديوگرام حاصل شود.

 

روش سَنجر  (Sanger)(پايانه زنجيره‌اي)

در اين روش پايانه زنجيره ديدِكسي (dideoxy)، پليمر از DNA يك كپي تكميلي نشان‌دار راديواكتيو از يك شاخه منفرد (ss) نمونه DNA با به‌كار بردن جزء DNA تكميلي كوتاه ss به عنوان آغازگر سنتز مي‌كند. سپس به طور تصادفي با يك ديدِكسي نوكلئوتيد (ddNTP) به جاي يك دي‌اكسي نوكلئوتيد (dNTP) مشاركت مي‌نمايد. لذا افزايش طول زنجيره هنگامي به پايان مي‌رسد كه ديدِكسي نوكلئوتيد با رشته مشاركت كند. محصولات به موازات شكاف يك ژل پلي‌آكريل آميد تجزيه و تحليل مي‌گردند. زنجيره مشتمل بر تري‌فسفات نوكلئوتيد نشان‌دار راديواكتيو در واكنش سنتز به طور طبيعي و قابل مشاهده رشد مي‌كند.

 

كاربردها

·         پروژه ژنوم انساني: مستلزم تعيين توالي ژنوم كل انسان.

 

واكنش زنجيره پليمرآز(PCR)

روش PCR سنتز مقادير ميكروگرم توالي‌هاي اسيدنوكلئيك ويژه را از هر بخش ژنوم (ماده كل ژنتيك يك ارگانيزم) امكان‌پذير مي‌سازد.

دو آغازگر اوليگونوكلئوتيد سنتز مي‌شوند كه از رشته‌هاي مخالف الگوي DNA تقويت شده حاصل مي‌شوند. DNA هدف در حضور مقادير اضافي دو آغاز‌گر تغيير ماهيت داده و سپس در يك درجه حرارتي كه دو آغازگر به DNA آنيل مي‌شوند باز گردانده مي‌شود.  يك پليمر از DNA پايدار- گرما (پليمراز Taq ) و كل چهار نوكلئوئيد تري فسفات‌ها در  واكنش حضور دارند. اين واكنش باعث ايجاد دو كپي از رشته‌هايي مي‌شود كه در بين آغاز‌گرها قرار مي‌گيرند.

سه مرحله بالا تكرار مي‌گردند. اين كار باعث توليد چهار كپي ديگر از رشته‌هاي به هم
پيوند شده با استفاده از آغازگرهاي اوليگونوكلئوتيد مي‌شود. در اصل ¢n¢ چرخهPCR تا n2 برابر هدف را تقويت مي‌كند. بنابراين، روش تجزيه‌اي يك روش فوق‌العاده قوي خواهد بود.

 

كاربردها

·         تشخيص بيماري‌هاي عفوني مثلT.B. ويروس هپاتيت B ، ويروس هرپس(herpes).

·         كاربردهاي جنائي براي شناسايي جنايت‌كاران با استفاده از ماده بيولوژيكي حاصل از صحنه جنايت.

 

 هيبريديزاسيون در محل

هيبريديزاسيون در محل مستلزم به كاربردن سوندهاي نشان‌دار در برخورد سلول‌ها و بخش‌هاي بافت است. اين مسئله منجر به محل‌گذاري واقعي در توالي هدف (مثلاً يك ژنوم ويروسي) در سلول خاصي، كه آن را پرورش مي‌دهد مي‌شود.

سوند با H3 نشان‌دار شده از روش ياخته‌اي با سوند نشان‌دار به مدت چند ساعت كشت مي‌شود. پس از هيبريديزاسيون، سوند اضافي پيوند نشده شسته شده و سوند آنيلد شده با تبديل به امولسيون فوتوگرافي آشكارسازي مي‌شود. تابش با امولسيون منتقل كننده دانه‌هاي نقره برهم‌كنش مي‌دهد. دانه‌ها درسطح تقريبي قرار مي‌گيرند كه سوند با كروموزوم‌ها پيوند مي‌دهد.

 

كاربردها

·          نگاشت توالي‌هاي مورد نظر دركروموزوم‌هاي متراكم.

·          تأمين اطلاعات سازمان يافته تابعي توالي‌ها در ميان هسته‌هاي فاز داخلي .

·          قرار گرفتن توزيع بافت كپي RNA.

·          توانايي شناخت محل دقيق ژن.

 

مراجع :

1.              Use of Radioisotopes in Biology, BRNS, BRIT-DAE, Mumbai

         (1989).


(1) A = آونين، T = تايمين، C = سيتوسين و G = گوانين